【MOF检测病菌】用于低水平细菌检测的高光致发光杆状微晶NH2-MIL-101（Fe）MOF分离和化学固定大肠杆菌特异性噬菌体

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摘要：
Institute of Chemical Technology (ICT)的Virendra Rathod等报道的本篇文章（Appl Organomet Chem. 2024, e7624）中开发了一种基于金属-有机框架(MOF)的光学生物传感器，用于快速、灵敏、准确地检测大肠杆菌(E. coli)。研究中合成了一种新型的氨功能化铁基MOF，即NH2-MIL-101(Fe)，通过溶剂热法合成，并利用SEM、XRD、ATR-FTIR、UV-VIS和光致发光(PL)光谱等方法进行了表征。从污水样本中分离出裂解噬菌体，并通过超离心法进行纯化和浓缩，最终获得高滴度7.3×10^12 PFU/ml。研究中优化了戊二醛浓度为0.25%，在30°C下，使8.6×10^5 PFU/ml的噬菌体与1 mg的氨功能化铁基MOF共轭，合成的检测探针展现出优异的光致发光和抗菌活性，实现了652 CFU/ml的检测限，响应时间为10-12分钟，具有高特异性和长期稳定性。因此，这种基于MOF的策略有助于使用噬菌体作为生物识别元件，特异性和灵敏地检测各种细菌病原体。

研究背景：
1. 世界卫生组织(WHO)对抗生素抗性和生物防御性细菌的关注度提高，需要开发出精确、快速、灵敏的检测方法，以应对病原体细菌的检测。
2. 其他学者的解决方案：传统方法包括选择性或差异性培养基中细菌的分离、菌落形态研究和一系列生化试验。免疫学检测，如ELISA、侧流试验、凝集试验等，以及一些高级的、耗时、昂贵和劳动密集型的方法，如聚合酶链反应(PCR)等，也被用于细菌检测。
3. 作者提出了一种使用噬菌体作为生物识别元件的MOF基光学生物传感器，利用氨功能化的Fe-MOF (NH2-MIL-101(Fe))微晶固定大肠杆菌特异性噬菌体，开发了一种超灵敏的光致发光光学生物传感器，用于定量检测大肠杆菌。

实验部分：
1. 噬菌体的分离、纯化和浓缩
     1) 收集ICT孟买校园的污水样本50 ml，离心去除大颗粒。
     2) 过滤后与双倍强度的Luria Bertini (LB) 肉汤混合，接种大肠杆菌(E. coli)，37°C过夜培养。
     3) 取100 ml培养液，加入1%氯仿，室温静置20-30分钟以灭活细菌。
     4) 离心后收集上清液，通过0.22 μm滤器过滤，使用斑点法确认噬菌体存在。
     5) 通过噬斑法进行分离，使用双琼脂层方法进行噬菌体的纯化。
     6) 通过超离心法(55000 rpm, 1小时, 4°C)进行噬菌体浓缩，最终重悬于5 ml PBS (pH 7.4)中，4°C保存。
   - 实验结果：噬菌体滴度达到7.3×10^12 PFU/ml。
2. NH2-MIL-101(Fe) MOF的合成
     1) 混合FeCl3·6H2O和NH2-BDC在DMF中，磁力搅拌后超声处理。
     2) 将混合物放入聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，150°C反应72小时。
     3) 通过离心分离MOF，用DMF、水和丙酮洗涤，80°C干燥过夜。
   - 实验结果：合成了NH2-MIL-101(Fe) MOF，具有约531-1106 nm的粒径。
3. 噬菌体与MOF的共轭
     1) 将100 mg MOF分散在10 ml PBS (pH 7.4)中，加入不同浓度的戊二醛。
     2) 搅拌后，通过离心和洗涤去除未反应的戊二醛。
     3) 将噬菌体溶液加入到戊二醛处理后的MOF中，过夜搅拌实现共轭。
     4) 使用BSA作为表面封闭剂防止非特异性结合。
   - 实验结果：在0.25%戊二醛浓度、30°C条件下，每1 mg NH2-MIL-101(Fe) MOF共轭了8.6×10^5 PFU/ml的噬菌体。
4. 光致发光检测
     1) 将噬菌体-MOF复合物与不同浓度的大肠杆菌溶液反应10分钟。
     2) 通过离心分离反应后的复合物，重悬于PBS中，测量光致发光强度。
   - 实验结果：在E. coli浓度为5.78×10^1至5.78×10^6 CFU/ml范围内，检测限为652 CFU/ml。

分析测试：
1. UV-VIS吸收和光致发光(PL)发射光谱：NH2-MIL-101(Fe) MOF在310 nm激发下显示出427 nm的特征宽PL光谱，噬菌体共轭后PL强度降低。
2. 动态光散射(DLS)：MOF粒径约为531-1106 nm，zeta电位从20 mV降至-33.6 mV，表明噬菌体成功共轭。
3. ATR-FTIR光谱：通过FTIR光谱确认了MOF的官能团，以及噬菌体共轭后形成的酰胺键。
4. XRD：XRD图谱显示了NH2-MIL-101(Fe) MOF的高结晶性，衍射峰与标准一致。
5. SEM成像：SEM图像显示MOF为三维棒状六角形微晶，尺寸约为2.8 μm×1.1 μm。
6. 稳定性和响应时间测试：噬菌体-MOF复合物在4°C下储存50天后，保持了对大肠杆菌的抗菌活性。
7. 特异性测试：在其他非特异性细菌存在下，噬菌体-MOF复合物显示出对大肠杆菌的高度特异性。
8. 污水样本分析：使用MOF-噬菌体传感器对实际污水样本进行分析，与标准平板计数法对比，恢复率为95-98%。

总结：
本研究成功开发了一种基于氨功能化铁基MOF的光学生物传感器，用于定量检测大肠杆菌。通过优化实验条件，实现了噬菌体与MOF的高效共轭，以及对大肠杆菌的高灵敏度检测。该传感器具有快速响应、高特异性和长期稳定性，为医学诊断、研究和工业应用中的病原体检测提供了新的策略。

展望：
本文的研究为病原体的快速检测提供了新的工具，可以进一步优化MOF的合成条件和噬菌体的固定方法，提高检测的灵敏度和稳定性。此外，探索该传感器在其他病原体检测中的应用；深入研究MOF与噬菌体相互作用的机理，将有助于设计出性能更优的生物传感器。

Isolation and chemical immobilization of E. coli-specific bacteriophage with NH2-MIL-101(Fe) MOF, a high photoluminescence rod-shaped microcrystals for low-level bacteria detection
文章作者：Santosh Sethi, Virendra Rathod
DOI：10.1002/aoc.7624
文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/aoc.7624

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