【COF固酶】共价有机框架共固定化全细胞和酶强化生物催化过程

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摘要：
南开大学陈瑶老师等报道的本篇文章（Nat Commun 2024, 15, 5510）中提出了一种将酶和细胞共固定化的新型平台，该平台利用共价有机框架（COFs）实现了高效、稳定且可回收的级联生物催化剂的制备。通过在COFs中均匀固定化酶，并在细胞表面形成涂层，制备出的级联生物催化剂展现出高效率、稳定性和可回收性。此外，该一锅法原位合成过程便于克级规模的酶-细胞生物催化剂的制造，连续流动装置可将菊糖转化为D-艾杜糖，实现了161.28 g L−1 d−1的空间产率和高稳定性（连续反应7天后保持>90%的初始催化效率）。该平台适用于多种细胞（如大肠杆菌、酵母）和酶，展示了良好的普适性。本研究为突破细胞内和细胞外催化的瓶颈，创建了高性能、可定制的酶-细胞级联生物制造平台，并拓展了生物催化过程强化的应用范围。

研究背景：
1. 工业规模的生物催化过程中，细胞和酶的共固定化至关重要，但目前仍面临巨大挑战。酶催化可能因高成本、低稳定性和难以回收而受限；而全细胞转化效率低，主要是因为细胞内物质传递不足和大底物的细胞外跨膜限制。
2. 已有研究集中在单独固定化细胞或酶，但细胞和酶的共固定化仍然面临挑战，如固定化载体可能在水溶液中因离子作用而解离，导致催化剂泄漏和系统稳定性降低。
3. 作者提出了一种COFs固定化平台，通过一锅法原位合成，将酶和细胞整合到COFs中，不仅提高了固定化效率，还实现了连续流动反应器中菊糖到D-艾杜糖的转化，展现了高稳定性和可回收性。

实验部分：
1. 合成NKCOF-141
   - 将BYTH和TB溶解在20 mL 水溶液中，加入醋酸，室温下反应2小时，通过离心和水洗得到NKCOF-141沉淀。
2. 制备E. coli@NKCOF-141
   - 在含有TB的PBS溶液中悬浮E. coli/DAE细胞，加入醋酸反应20-30分钟，随后加入含BYTH的PBS溶液，继续反应2小时，通过离心和PBS洗涤得到E@NKCOF-141。
3. 合成INU@NKCOF-141
   - 将INU酶粉末加入含有BYTH和TB的水溶液中，加入醋酸，室温下反应2小时，通过离心和PBS洗涤得到INU@NKCOF-141。
4. 构建酶-细胞共固定化生物催化剂
   - 将E. coli细胞与INU-NH2在含有TB的PBS溶液中混合，加入BYTH和醋酸，室温下反应2小时，通过离心和PBS洗涤得到INU-NH2&E-NH2@NKCOF-141。
5. 连续流动反应器中D-艾杜糖的生产
   - 将INU-NH2&E-NH2@NKCOF-141填充到柱反应器中，以0.1 mL min−1的流速泵入菊糖溶液，通过HPLC分析连续收集的流出液中的D-艾杜糖含量。

分析测试：
1. 粉末X射线衍射（PXRD）
   - NKCOF-141、E@NKCOF-141和INU@NKCOF-141的PXRD模式显示了其晶体结构，其中E@NKCOF-141的PXRD数据在图2b中展示。
2. 氮气吸附-脱附等温线
   - NKCOF-141的BET比表面积为275 m²/g，E@NKCOF-141由于细胞包埋降至154 m²g−1。氮气吸附等温线在图2c中展示。
3. 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）
   - FT-IR光谱（图2d）显示了NKCOF-141、E和E@NKCOF-141之间的化学键合，其中E@NKCOF-141的C=O伸缩振动从1633 cm−1（自由E）蓝移至1660 cm−1。
4. 透射电子显微镜（TEM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）
   - TEM图像（补充图5）显示了E@NKCOF-141细胞表面粗糙化，COF颗粒均匀包裹细胞。CLSM图像（图3b和4）显示了FITC-INU-NH2在E-NH2表面均匀分布。
5. 酶活性测定
   - 固定化前后的INU和E. coli/DAE的酶活性通过测量反应液中D-艾杜糖的产生量来评估。INU-NH2&E-NH2@NKCOF-141在最佳条件下（50°C，pH 6.5）的D-艾杜糖产量为0.367 μmol mL−1 min−1。
6. 稳定性和可回收性测试
   - INU-NH2&E-NH2@NKCOF-141在60°C处理20分钟后的级联活性保持了84%，而未处理的自由INU-NH2&E-NH2只保留了23%。在甲醇和乙醇处理后，固定化的催化剂保持了>80%的级联活性，而自由催化剂活性降低至低于25%。
7. 连续流动反应器性能测试
   - 在50°C和0.2 mL min−1的条件下，D-艾杜糖的空间产率达到161.28 g L−1 day−1。在室温（30°C）和0.1 mL min−1的条件下，连续流动反应14天后，D-艾杜糖的空间产率保持在61.56 g L−1 day−1。

总结：
本文通过在COFs中共固定化酶和细胞，成功构建了一种新型的级联生物催化剂。该催化剂在连续流动反应器中展现出了优异的催化效率和稳定性，为生物催化过程的强化提供了一种有效的策略。

展望：
本研究为生物催化过程的强化提供了新的视角，未来的工作可在以下几个方面进行深入：
1. 长期稳定性测试：在更长时间的运行条件下，评估催化剂的稳定性和活性保持情况。
2. 机理研究：深入研究酶和细胞在COFs中的相互作用及其对催化过程的影响。

Co-immobilization of whole cells and enzymes by covalent organic framework for biocatalysis process intensification
文章作者：Dong Zheng, Yunlong Zheng, Junjie Tan, Zhenjie Zhang, He Huang & Yao Chen
DOI：10.1038/s41467-024-49831-8
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-49831-8

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