【MOF固酶】：同步提高酶稳定性和活性的协同孔分隔和疏水策略

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摘要：
中山大学陈国胜&黄怀义&欧阳钢锋&广州医科大学黄思铭老师等报道的本篇文章（J. Am. Chem. Soc. 2024）中提出了一种新颖的协同孔道分隔和疏水化策略，旨在同步提升酶的稳定性和活性。通过利用金属-有机框架（MOF）材料的孔道工程，特别是层级孔道结构的NU-1003，实现了脂肪酶（一种重要的水解酶）的高效捕获。该策略通过在介孔通道中精确修饰链长可调的脂肪酸，成功地将脂肪酶固定化，同时保持了与外界介质的有效沟通。这种结构不仅确保了脂肪酶的高可及性，而且通过脂肪酸介导的疏水孔道激活了脂肪酶的开放构象，从而提高了其催化活性。实验结果表明，与天然脂肪酶相比，固定化的脂肪酶在酯水解和对映体选择性催化反应中的活性分别提高了1.57倍和2.46倍。此外，这些异质生物催化剂在动力学分辨率的手性化合物中的应用也得到了验证，显示出比天然脂肪酶更高的效率。本研究不仅解决了酶固定化过程中稳定性与活性之间的权衡问题，而且为设计具有高催化稳定性和活性的生物催化剂开辟了新的途径。

研究背景：
1）在生物制造领域，酶作为一种高效的生物催化剂，由于其在复杂环境中的稳定性和循环使用性较差，限制了其在工业应用中的效率和成本效益。
2）现有的酶固定化方法，如吸附、共价键合、交联和嵌入等，虽然能够在一定程度上提高酶的稳定性和循环使用性，但往往以牺牲酶的催化活性为代价。
3）本文作者提出了一种金属-有机框架（MOF）孔道工程策略，通过精确修饰孔道，同时实现了酶稳定性和活性的提升。特别是利用链长可调的脂肪酸对介孔通道进行修饰，捕获了脂肪酶，并通过界面相互作用激活酶的开放构象。

实验部分：
1) MOF的合成与表征：作者合成了具有层级孔道结构的NU-1003 MOF，并通过粉末X射线衍射（PXRD）和扫描电子显微镜（SEM）进行了表征，确认了其高度晶态的结构。
2) 酶的固定化：通过后渗透策略将脂肪酶（TL）加载到NU-1003和MCM-41的介孔通道中。利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）确认了TL的成功加载，并通过氮气吸附-脱附等温曲线测试了材料的孔结构变化。
3) 催化性能测试：使用对硝基苯基棕榈酸酯（p-NPP）作为底物，评估了TL@NU-1003和TL@MCM-41的催化水解动力学。TL@NU-1003展现出与游离TL相当的初始水解速率，比TL@MCM-41高出1.52倍。
4) 脂肪酸修饰的MOF孔道：利用溶剂辅助配体掺入（SALI）方法，将直链脂肪酸精确修饰到NU-1003的介孔壁上，合成了不同链长的脂肪酸修饰的NU-1003-X（X = C12, C16, C20, C22）。
5) TL在脂肪酸修饰孔道中的分布：通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）实验，研究了罗丹明B（RhB）预标记的TL在MOF晶体中的分布情况。
6) 催化水解性能评估：选择p-NPP作为酯底物，评估了TL@NU-1003-X的催化性能，发现随着脂肪酸链长的增加，催化活性逐渐增强，尤其是使用了二十二酸（C22）修饰的TL@NU-1003-C22，表现出最高的水解速率。
7) 稳定性测试：TL@NU-1003-C22在酸性、碱性、高温和有机溶剂环境下的稳定性测试，表现出比天然TL更高的生物活性保留率。

分析测试：
1) 孔道结构分析：通过XRD和SEM确认了NU-1003和MCM-41的晶体结构和形貌，氮气吸附-脱附等温曲线分析显示TL@NU-1003和TL@MCM-41的比表面积和孔容显著降低，表明TL成功固定在介孔中。
2) FT-IR光谱分析：FT-IR光谱显示了TL在NU-1003和MCM-41中的成功固定化，酰胺I带的位置和强度变化反映了肽键的振动。
3) 热重分析（TGA）：TGA分析了TL@NU-1003-X样品的热稳定性，观察到在大约300−500 °C的重量损失，归因于修饰脂肪酸的热解。
4) 核磁共振（1H NMR）：1H NMR用于定量分析每个Zr6节点上的脂肪酸含量，发现短链脂肪酸的修饰效率高于长链脂肪酸。
5) 接触角测量：测量了NU-1003和NU-1003-X的接触角，发现修饰后的NU-1003-X的亲水性降低，表明了材料表面疏水性的增加。
6) 拉曼光谱分析：拉曼光谱分析了TL@NU-1003-C22样品中脂肪酸的空间分布，确认了脂肪酸在整个介孔通道壁上的均匀修饰。
7) ITC和ssNMR分析：通过ITC和ssNMR分析了TL与NU-1003和NU-1003-C22孔道的界面相互作用，发现了TL与修饰脂肪酸之间的疏水相互作用。
8) 动力学分辨率测试：TL@NU-1003-C22在动力学分辨率的手性化合物中的测试显示，其在11小时内达到了39.95%的(R)-1-苯乙醇转化率，而天然TL仅达到16.23%。
9) 循环利用测试：TL@NU-1003-C22的循环利用测试表明，即使在4次循环后，其催化转化率仍保持在80%以上。

总结：
本文通过MOF孔道工程策略，实现了酶的稳定性和活性的同步提升。利用层级孔道结构和脂肪酸的疏水修饰，不仅保持了酶的高可及性，还通过界面相互作用激活了酶的催化活性。实验结果表明，与原始酶相比，固定化的酶在酯水解和对映体选择性催化反应中表现出更高的活性。

展望：
本文的研究为设计具有高催化稳定性和活性的异质生物催化剂提供了新的思路，对未来的生物制造和酶工程领域具有重要的指导意义。

A Synergetic Pore Compartmentalization and Hydrophobization Strategy for Synchronously Boosting the Stability and Activity of Enzyme
文章作者：Lihong Guo, Rongwei He, Guosheng Chen*, Huangsheng Yang, Xiaoxue Kou, Wei Huang, Rui Gao*, Shuyao Huang*, Siming Huang*, Fang Zhu, and Gangfeng Ouyang*
DOI：10.1021/jacs.4c03286
文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c03286

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