针对阿尔茨海默病（AD）相关淀粉样蛋白b（Ab）纤颤的新型纳米结构抑制剂的开发和探索引起了广泛关注，并成为纳米医学的一个新前沿。然而，专注于寻找有效的纳米结构是治疗任务中最具挑战性的部分之一。AD是一种进行性、致命性的神经退行性疾病，由于世界人口老龄化和缺乏有效的治疗手段，AD给社会和家庭带来了巨大的社会经济负担在探索体内毒性物质性质的过程中，越来越多的证据表明Ab的细胞毒性聚集可能是AD发生发展的主要原因。主流观点认为，可溶性和结构化的Ab寡聚体和成熟的淀粉样纤维对AD的发生和发展至关重要，从而导致神经功能紊乱和神经元凋亡。因此，合理设计有效的淀粉样蛋白形成抑制剂被认为是AD的主要治疗策略。

一般来说，这些抑制剂受到主要问题的限制，包括（1）缺乏足够的吸附能力，因为参与表面的大尺寸导致低的结合亲和力。（2）由于Ab的开/关途径组装过程的动态性质，与“错误”靶点结合。在这方面，Ab纤维化抑制剂的适用性至少需要两个关键的结构方面：足够的能力和特异性靶向性。作者提到，具有Ab特异性识别的纳米多孔抗淀粉样变性材料的研究很少。基于以上讨论，作者首次报道了磷酸钠（SP）基团功能化纳米球形共价有机框架（COF）作为抗Ab纤颤抑制剂的合成、特性和评估。

在此，通过在通道网络上与磷酸钠（SP）基团进行合成后功能化，发现纳米级球形共价有机框架（COF）可有效抑制Ab纤颤。通过多种显微和光谱技术对制备的具有高比表面积、良好结晶性和化学稳定性的均匀SP-COF纳米球进行了表征。此外，分子动力学模拟以及纤颤动力学和细胞毒性试验表明，SP COF中存在限制性访问的吸附通道，这些通道由大小和官能团与Ab肽序列相适应的空腔形成，显著影响Ab的纤颤和细胞毒性。透射电镜（TEM），通过动态光散射（DLS）监测、等温滴定量热法（ITC）、傅立叶变换红外（FT-IR）和圆二色性（CD）光谱测量以及共聚焦成像观察，了解SP COFs的抑制机制和影响因素，该策略是首次探索具有高亲和力和特异性靶向性的基于COF的抗淀粉样变性纳米材料，这对于抑制Ab纤颤以预防和治疗AD至关重要。

合成SP-COFs

方案1：通过TD-COFs磷酸化合成SP-COFs的示意图

表征SP-COFs

采用透射电镜(TEM)和动态光散射(DLS)对SP-COFs的形貌和大小进行了初步研究。

通过粉末x射线衍射(PXRD)测定球形COFs的结晶度。在77 K下，通过N2吸附-解吸分析测量TD COFs和SP COFs的表面积和孔隙率。测量TD COFs和SP COFs的Brunauer–Emmett–Teller（BET）表面积分别为242.469 m3g -1和231.233 m3g -1。

图1：TD COFs和SP COFs的TEM、DLS、PXRD、BET和FTIR表征

图2：SP-COFs的XPS图谱

分子动力学模拟

选择Ab42肽作为靶点（已被确定为与AD相关的有效细胞毒素）。进行分子动力学模拟，以探索SPCOF（表示为SP-COF）单孔与Ab42之间的作用机制。SP-COF和Ab42肽对接在水溶液中，以预测结合位点、结合模式、结合能值和分子构象，以便后续分析，如图3所示。根据RCSB PDB晶体数据库，Ab42肽包含一个准圆形的螺旋-螺旋晶体结构。此外，Ab42肽静态形态的总长度为50.9 A，螺旋圆形横向平面的三个横向最大半径分别为16.1 A、16.0 A和16.5 A（图3A），这与SP COFs的模拟孔径（约2.3 nm）非常一致。通过比较，SP-COF的空腔直径分别为23.0 A、26.5˚A和30.2˚A（图3B），略大于Ab42的横向半径。此外，SP-COFs和Ab42单孔之间的半径比较前视图（图3C）和半径比较顶视图（图3D）直接表明，Ab42肽序列有被SP-COF吸附的可能性。

图3：SP-COFs (SP-COFs的单孔)通过主客体识别结合Ab42多肽并靶向Ab42序列的特定氨基酸位点的作用。模拟Ab42肽横半径(A)和SP-COF (B);(C) Ab42与SP-COF半径比较前视图;(D) Ab42与SP-COF半径比较俯视图。(E) Ab42和SP-COF在分子动力学过程中0-5ns时间点的结构相。(F)分子动力学过程中Ab42与SP-COF在0-5ns时间点的相互作用

SP-COFs作为抗Ab42肽纤颤抑制剂的评价

TEM首次用于研究受SP COFs影响的Ab42的形态变化和大小分布。

图4：在Ab42浓度为5 mM的60 mg mL -1条件下，无和存在SP COF时的纤颤时间过程的TEM图像

采用等温滴定量热法(ITC)定量测定SP-COFs和Ab42。同时检测TD-COFs作为对照组。图5A和B，从ITC数据获得的熵和焓（DH）变化研究表明，SP COF和TDCOF均与Ab42单体表现出纯放热相互作用。具体而言，它们以1:1的化学计量比与Ab42相互作用，结合常数Kd（TDCOFs）分别为1.38 ×104 M-1和Kd（SP COFs）分别为3.79 ×107 M -1。TC数据表明，由于SP- COFs对SP组的特异性识别，其与Ab42的结合力比TD-COFs强3个数量级。结果证明，磷酸化可以特异性靶向Ab42，协同增强与Ab42的结合力。

图5：SP COFs对Ab42纤维化过程的影响。（A和B）与TD COFs（A）和SP COFs（B）孵育的Ab42的ITC曲线。（C） 添加TD-COFs和SPCOFs（60 mg mL-1）的Ab42（5 mM）的纤颤动力学（缓冲液：50 mM PBS，含0.02%NaN3，pH=7.40）。（D） SP-COFs的结合特异性。分别添加单一氨基酸（50 mM，Ab42的10倍）的SP COFs和Ab42共孵育系统的ThT荧光分析（共孵育12 h）。（E） SP-COFs存在下Ab42纤颤时间过程的FT-IR光谱。（F） Ab42与SP-COFs的CD谱

SP-COFs的细胞成像和细胞毒性实验

在此，PC12细胞被用作神经元模型，以评估SP COFs对细胞活力和Ab42诱导的细胞毒性的影响。在PC12细胞实验之前，通过监测与细胞sap共孵育96小时前后SP COFs的形态变化，研究了SPCOFs细胞sap中的稳定性。

图6：激发光为488 nm时，60 mg mL -1 DMBPD&SP COFs（A）、5 mM FITC-Ab42（B）、60 mg mL -1 DMBPD&SP COFs和5 mM FITC-Ab42共培养系统（C）的CLSM图像。暗场（左）、亮场（中）和叠加场（右）

最后，研究了SP-COFs的细胞毒性及其对淀粉样蛋白珠光的影响。作者采用标准的3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基- 2h -四唑溴化铵(MTT)方法来评估细胞增殖和细胞毒性。

图7：用标准MTT法测定细胞活力

综上所述，本研究描述了功能化均匀COF纳米球中SP基团的构建，并利用它们来探索SP-COF对淀粉样纤维颤动的影响。结果表明，SP组遵循双重策略，将COF的分散性改善与靶向Ab42序列的过程特异性功能相结合。此外，SP-COF由于其大表面积、纳米球形、适当的空腔尺寸和AA堆积模式以及带负电的磷酸基团的优势，作为一种有效的抑制剂，通过主客体识别增强Ab42上的吸附力，并专门捕获Ab42肽序列上的正电荷氨基酸位点。模拟指导以及多种生物物理和生化表征结果表明，SP-COFs专门针对Ab42残基的侧链。具体而言，SP基团与带正电荷的位点（Lys16、Lys28）以及与疏水残基（Leu17、Val18、Phe19、Phe20）发生疏水相互作用的SPCOF介孔微环境发生静电相互作用，导致SP COF与Ab42之间具有结合特异性的结合亲和力，显著影响Ab42的纤颤和细胞毒性。作者的研究很好地弥补了无孔抗淀粉样蛋白原材料的缺点，开发了一种新型的Ab纤颤抑制剂，在足够的容量和特异性靶向性两个关键结构方面具有优势，为纳米抑制剂的研究指明了新的方向。然而，这项研究只是一个初步的探索，深入了解SP-COFs对淀粉样变过程的影响以及在体内的生物分布和毒性评估将是作者未来工作的主题。